1.平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外,取规定量供试品,按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定,每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
培养和计数 除另有规定外,胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~35℃培养3~5天,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20~25℃培养5~7天,观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数,计数并。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数规则菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
菌数规则 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级,作为菌数的依据。取zui高的平均菌落数,计算1g、1ml或10c㎡供试品中所含的微生物数,取两位有效数字。
如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅zui低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1 时,以<1 乘以zui低稀释倍数的值菌数。
培养基适用性检查
微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
学习:类似于无菌检查法,此处将“成品培养基”修改为“商品化的预制培养基”,表述,下文还有,不再赘述。
计数方法适用性试验
供试液制备
根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应**过45°C。供试液从制备至加人检验用培养基,不得**过1小时。
学习:此处应注意同时进行数个品种计数方法适用性试验时的时效问题。“供试液制备”这一节,微生物机构,水溶性供试品、水不溶性非油脂供试品、油脂类供试品的制备方法无变化。在2020版药典中,将原“(4)需用特殊方法制备供试液的供试品”中的小类(四种)提升至与上述3类并列表述,除气雾剂供试品外,制备方法无变化。具体是膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂供试品(2015版:气雾剂、喷雾剂供试品)、贴剂、贴膏剂供试品(2015版:贴膏剂供试品)。
微生物限度方法主要包括3种。
1.微生物计数法:该种方法用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准。检验项目分别为:需氧菌、霉菌及酵母菌计数。其中,需氧菌计数方法适用性试验:铜绿假单胞菌、金黄色、枯草芽孢。霉菌及酵母菌计数方法适用性试验:白色、黑曲霉。
2.控制菌检查法:控制菌检查法系用于在规定的试验条件下,检査供试品中是否存在特定的微生物。分别为培养基适用性检查和控菌检查方法适用性试验。控制菌计数方法适用性试验:耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、梭菌、白色。
3.方法学适用性试验:药品的微生物计数方法应进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。